A pesar de la malignidad in vivo, el ependimoma carece de modelos de cultivo celular, limitando así el desarrollo de terapias. Aquí, utilizamos un sistema de cultivo tridimensional (3D) ajustable para aproximar el microambiente del ependimoma y recapitular un tumor de un paciente in vitro. Nuestros datos mostraron que la inclusión de VEGF en medios de cultivo celular sin suero, mixtos de células neurales y endoteliales, apoyó el crecimiento in vitro de las cuatro muestras de pacientes con ependimoma. El crecimiento fue impulsado por células doblemente positivas para Nestina y Ki67 en un nicho de células madre cancerosas putativo, que se manifestó como agrupaciones con aspecto de roseta en 2D y esferoides en 3D. Los efectos de la matriz extracelular (ECM) como colágeno o Matrigel superaron a los de las condiciones del medio, siendo Matrigel el que resultó en un mayor enriquecimiento de células positivas para Nestina. Cuando se mezclaron con células endoteliales, los modelos de cocultivo 3D desarrollaron redes capilares que se asemejaban a la vasculatura del ependimoma in vivo. El análisis transcriptómico de dos casos de pacientes demostró la separación de cultivos in vitro por pacientes individuales, con las muestras de cultivo de un paciente agrupadas estrechamente con el tejido tumoral primario. Si bien se encontró que el VEGF era necesario para preservar las características transcriptómicas de los cultivos in vitro, la presencia de células endoteliales cambió los patrones de expresión génica, especialmente los genes asociados con la remodelación de la ECM. Los genes homeobox se vieron mayormente afectados en los modelos in vitro 3D en comparación con el tejido tumoral primario y entre diferentes formatos 3D. Estos hallazgos proporcionan una base para comprender el microambiente del ependimoma y permitir el desarrollo adicional de modelos de ependimoma in vitro derivados de pacientes para la medicina personalizada.