El flujo inducido por un agitador orbital se sabe que produce estrés cortante y flujo oscilatorio, pero la utilidad de este modelo para estudiar los efectos de la carga mecánica en los osteoblastos no está bien definida. Para probar esto, se cultivaron osteoblastos derivados de los huesos largos de ratones machos adultos C57BL/6J en placas de 6 pocillos y se sometieron a agitación orbital a varias frecuencias (0.7, 1.4 y 3.3 Hz) durante 30 y 60 minutos en medios de diferenciación sin suero. El estrés cortante en las células producido por las frecuencias de agitación de 0.7, 1.4 y 3.3 Hz fue de 1.6, 4.5 y 11.8 dynes/cm, respectivamente. La actividad de ALP medida 72 horas después de la agitación (flujo orbital) mostró un aumento significativo a 0.7 y 1.4 Hz, pero no a 3.3 Hz, en comparación con los controles estáticos. El estrés mecánico inducido por el flujo orbital también aumentó significativamente (25%) la proliferación de osteoblastos a un flujo de 0.7 Hz en comparación con los controles estáticos. Además, los niveles de expresión de los marcadores de formación ósea, , , y se incrementaron significativamente (de 1.5 a 3 veces, < 0.05) en las células sometidas a un flujo de 0.7 Hz en comparación con las células de control no cargadas. También evaluamos el efecto del flujo orbital en las vías de señalización clave (mTOR, JNK y WNT) conocidas por mediar los efectos de la tensión mecánica en los osteoblastos. Encontramos que bloquear la señalización de mTOR y WNT con inhibidores redujo significativamente (20-30%) la actividad de ALP inducida por el flujo orbital en comparación con las células tratadas con un vehículo. En contraste, la inhibición de la señalización de JNK no afectó la diferenciación de osteoblastos inducida por el flujo. En conclusión, nuestros hallazgos muestran que el flujo producido por un agitador orbital a una frecuencia más baja es un modelo apropiado y económico para estudiar las vías moleculares que median los efectos de la tensión mecánica en cultivos primarios de osteoblastos in vitro.