La edición del genoma ha demostrado su utilidad en la generación de modelos de enfermedad basados en células isogénicas, permitiendo la introducción precisa de alteraciones genéticas en células tipo salvaje para imitar fenotipos de enfermedad y explorar los mecanismos subyacentes. Sin embargo, su aplicación en enfermedades relacionadas con el hígado ha estado limitada por los desafíos en la modificación genética de hepatocitos maduros en un plato. Aquí, realizamos una comparación sistemática de varios métodos para el cultivo de hepatocitos primarios y la entrega de genes para lograr una edición robusta del genoma de hepatocitos ex vivo. Nuestros esfuerzos lograron eficiencias de edición de hasta el 80% en hepatocitos murinos primarios cultivados en monocapa y del 20% en organoides. Para modelar la tumorogénesis hepática humana, utilizamos hepatocitos diferenciados de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) como una fuente alternativa de hepatocitos humanos. Desarrollamos una serie de modelos celulares introduciendo diversas alteraciones oncogénicas individuales o combinadas en hepatocitos derivados de hPSC. Nuestros hallazgos demostraron que patrones mutacionales distintos llevaron a variaciones fenotípicas, afectando tanto el crecimiento excesivo como los perfiles transcripcionales. Notablemente, descubrimos que el mutante PI3KCA E542K, ya sea solo o en combinación con c-MYC exógeno, perjudicó significativamente las funciones de los hepatocitos y facilitó la reprogramación metabólica del cáncer, destacando los roles críticos de estos genes frecuentemente mutados en la conducción de la neoplasia hepática. En conclusión, nuestro estudio demuestra que los hepatocitos diseñados genéticamente son modelos celulares valiosos de hepatocarcinoma, proporcionando información sobre los mecanismos de tumorogénesis temprana.