La toxicidad del aluminio (Al) es una grave limitación ambiental que enfrenta la producción de cultivos en suelos ácidos, principalmente debido al daño oxidativo que causa en los tejidos de las plantas. La alfalfa, un cultivo forrajero de importancia global, es altamente susceptible al estrés inducido por Al, lo que requiere el desarrollo de cultivares tolerantes al Al para una producción forrajera sostenible. En este estudio, investigamos el papel regulador de miR156 en la respuesta al estrés por Al en alfalfa. El análisis de transcritos reveló una significativa downregulación de miR156 en las raíces de alfalfa después de 8 horas de exposición al Al, sugiriendo un papel negativo para miR156 en respuesta al Al. Para investigar más a fondo el papel de miR156 en la regulación de rasgos agronómicos y la tolerancia al Al de la alfalfa, utilizamos el método de imitación de objetivo en tándem corto (STTM) para silenciar miR156 en alfalfa (MsSTTM156), lo que llevó a una upregulación de los genes objetivo de SQUAMOSA PROMOTER BINDING-LIKE (SPL), aunque con efectos variables dependientes de la dosis de miR156 en diferentes genotipos transgénicos. La caracterización morfológica de las plantas MsSTTM156 reveló cambios negativos significativos en la arquitectura de las raíces, la biomasa de raíces y brotes, así como en el tiempo de floración. Bajo estrés por Al, la sobreexpresión de miR156 en alfalfa (MsmiR156OE) resultó en un crecimiento atrofiado y una biomasa reducida, mientras que el silenciamiento moderado de MsmiR156 mejoró el peso seco de las raíces y aumentó el diámetro basal del tallo. En contraste, MsmiR156OE redujo la altura de la planta, el diámetro basal del tallo, la ramificación de los brotes y la biomasa total en condiciones de estrés por Al. A nivel molecular, el silenciamiento de miR156 moduló la transcripción de genes relacionados con la pared celular vinculados a la tolerancia al Al, como la poligalacturonasa 1 y la poligalacturonasa 4. Además, miR156 influyó en la expresión de genes relacionados con el transporte de ácido indol-3-acético (IAA), como la proteína transportadora de auxina y los componentes del transportador de eflujo de auxina 2, mostrando las plantas MsSTTM156 y MsmiR156OE niveles de transcritos más bajos y más altos, respectivamente, tras la exposición al Al. Estos hallazgos revelan el papel multifacético de miR156 en la mediación de la tolerancia al Al, proporcionando valiosos conocimientos sobre las estrategias genéticas que regulan la respuesta al estrés por Al en la alfalfa.