La miofilina es una glicoproteína secretada con una función biológica poco comprendida y se conoce principalmente como el primer gen del glaucoma. Para explorar el papel normal de esta proteína in vivo, desarrollamos una línea de pez cebra knockout (KO) utilizando la edición del genoma CRISPR/Cas9. Esta línea presenta una variante homocigota (c.236_239delinsAAAGGGGAAGGGGA) que se predice que resulta en una pérdida de función de la proteína debido a un codón de terminación prematuro p.(V75EfsX60) que resultó en una reducción significativa de los niveles de ARNm. La inmunohistoquímica mostró la presencia de miofilina en estructuras del segmento anterior del ojo embrionario (96 h post-fertilización) y en los músculos caudales. La proteína también fue detectada en diferentes tejidos oculares y no oculares en adultos. No se identificaron alteraciones macroscópicas o microscópicas en los peces cebra KO, pero, notablemente, observamos la ausencia de hembras entre los animales adultos KO y apoptosis en la gónada juvenil inmadura (28 dpf) de estos animales, lo cual es característico del desarrollo masculino. El análisis transcriptómico mostró que los machos adultos KO sobreexpresaban genes clave involucrados en la determinación del sexo masculino y presentaban genes de señalización Wnt expresados diferencialmente. Estos resultados muestran que la miofilina es necesaria para la diferenciación del ovario en el pez cebra y proporcionan apoyo in vivo para el papel de la miofilina como modulador de la vía de señalización Wnt. En resumen, esta línea de pez cebra KO puede ser útil para investigar la elusiva función de esta proteína y proporciona evidencia de la inesperada función de la miofilina como un factor clave en la determinación del sexo en el pez cebra.