La microscopía de fluorescencia por reflexión total interna (TIRF) de molécula única permite la visualización en tiempo real de la dinámica macromolecular y el ensamblaje complejo. Los microscopios TIRF basados en prismas (prismTIRF) son relativamente simples de operar y se pueden modular fácilmente para adaptarse a las necesidades de una amplia variedad de aplicaciones experimentales. Si bien construir un microscopio prismTIRF sin asistencia experta puede representar un desafío significativo, los componentes necesarios para construir un microscopio prismTIRF son relativamente asequibles y, con algo de orientación, el ensamblaje puede ser completado por un novato decidido. Aquí, proporcionamos una guía fácil de seguir para el diseño, ensamblaje y operación de un microscopio prismTIRF de tres colores que puede ser utilizado para el estudio de complejos macromoleculares, incluidos los complejos de proteínas-ADN de múltiples componentes responsables de la reparación, replicación y transcripción del ADN. Nuestra esperanza es que este artículo pueda ayudar a los laboratorios que aspiran a implementar técnicas TIRF de molécula única y, en consecuencia, expandir la aplicación de esta tecnología.