El glucocálix (GCX), un hidrogel rico en carbohidratos pericelulares, forma una barrera selectiva que protege la membrana celular, proporciona soporte mecánico y regula el transporte y la difusión de moléculas. El GCX es una estructura frágil, lo que dificulta su estudio mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) y microscopía confocal de barrido láser (CLSM). La preparación de muestras mediante fijación química convencional destruye el GCX, dando una falsa impresión de su organización. Un desafío adicional es procesar el GCX de manera que se preserve su morfología y se mejore su antigenicidad para estudiar su composición específica de células. El objetivo de este estudio fue proporcionar un protocolo para preservar tanto la accesibilidad de antígenos como la morfología única del GCX. Establecimos un método combinado de congelación a alta presión (HPF), sustitución por congelación sin osmio (FS), rehidratación y etiquetado inmunogold previo a la inclusión para TEM. Nuestros resultados mostraron un etiquetado inmunogold específico de los componentes del GCX expresados en células monocíticas humanas THP-1, el receptor de ácido hialurónico (CD44) y el sulfato de condroitina (CS), y mantuvieron una morfología del GCX bien preservada. Adaptamos el protocolo para la localización de antígenos mediante CLSM y confirmamos el patrón de distribución específico de los componentes del GCX. La combinación presentada de HPF, FS, rehidratación y etiquetado inmunológico tanto para TEM como para CLSM ofrece la posibilidad de analizar la morfología y composición de la estructura única del GCX.