Antecedentes: Los aceites esenciales han ganado importancia debido a sus diversas actividades biológicas, y hay una creciente demanda de ellos en muchas industrias. El presente artículo se centra en los pasos técnicos para una evaluación in vitro de las actividades antibacterianas y antibiofilm de los aceites esenciales para su posible uso como irrigante de conducto radicular en odontología. Métodos: Las bioactividades del aceite esencial fueron investigadas a través de ensayos in vitro. La bacteria grampositiva fue utilizada como modelo de microorganismo. La actividad antibacteriana del aceite esencial fue evaluada utilizando el método de microdilución, y la tinción de resazurina para determinar las concentraciones mínimas de inhibición (CMI) y las concentraciones mínimas bactericidas (CMB). El efecto antibiofilm fue evaluado espectrofotométricamente a 570 nm utilizando la técnica de cultivo en microplacas y la tinción con violeta de cristal. Conclusiones: Este artículo presenta un protocolo detallado in vitro para facilitar la preparación de las muestras de aceite esencial, la suspensión bacteriana y los métodos utilizados para la evaluación de las actividades antibiofilm y antibacterianas del aceite esencial. Se presentan las ventajas de estos enfoques en relación con los límites vinculados a la elección de la bacteria y el aceite esencial.