La edición del genoma utilizando el sistema CRISPR/Cas9 es una de las metodologías más populares en la comunidad científica. Muchos enfoques de edición del genoma requieren Cas9 recombinante (Cas9) en algún momento durante su aplicación, por ejemplo, para la validación in vitro de ARN guía único (SgRNAs) o para la edición sin ADN de genes de interés. Por la presente, proporcionamos un protocolo simple y detallado de expresión y purificación para Cas9 como proteína fusionada a GFP y MBP. Este protocolo mejora el rendimiento de la proteína y simplifica el proceso de purificación al superar obstáculos que ocurren con frecuencia, como la pérdida de plásmidos, niveles inconsistentes de expresión de proteínas o una unión inadecuada de la proteína a resinas de afinidad. En promedio, este protocolo produce 10 a 30 mg de proteína purificada activa, His6-MBP-Cas9 NLS-GFP. La pureza abordada a través de SDS-PAGE es > 80%.