La hipótesis de la célula madre del cáncer (CSC) sugiere que los tumores son sostenidos exclusivamente por una pequeña población de células con propiedades de células madre. Los CSC han sido identificados en la mayoría de los tumores y son responsables de la iniciación, recurrencia y resistencia de diferentes tipos de cáncer. En modelos de CSC in vitro serán de gran ayuda para revisar el mecanismo del desarrollo del cáncer, así como el microambiente tumoral y la heterogeneidad del cáncer y la metástasis. Nuestro grupo describió recientemente la generación de CSC a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC), que fueron reprogramadas a partir de células normales y/o células madre embrionarias (ESCs). Este procedimiento mejorará la comprensión del nicho esencial involucrado en la iniciación del cáncer. La composición de este nicho inductor de cáncer, si se identifica, nos permitirá saber cómo las células normales se convierten en malignas en el cuerpo y cómo, a su vez, se podría lograr la prevención del cáncer. Además, una vez desarrollados, los CSC demuestran la capacidad de diferenciarse en células endoteliales, fibroblastos asociados al cáncer y otros fenotipos estableciendo el nicho de CSC. Estos serán buenos materiales para desarrollar nuevos tratamientos contra el cáncer. En este protocolo, describimos cómo manejar las iPSC/ESCs de ratón y cómo elegir el momento crítico para comenzar la conversión en CSC. Este protocolo de generación de CSC es esencial para comprender el papel de los CSC en la iniciación y progresión del cáncer.