La cuantificación de carotenoides libres y unidos en matrices de frutas y verduras pigmentadas ha sido previamente desafiante debido a la inestabilidad de los carotenoides, la degradación durante la extracción y la prevalencia de ésteres de carotenoides predominantes. El objetivo del presente estudio fue desarrollar un procedimiento de extracción optimizado que minimice la pérdida de carotenoides libres y unidos utilizando una combinación de soluciones de extracción, seguido por un proceso de saponificación mejorado. Una mezcla de hexano, diclorometano, etanol y agua logró la mayor eficiencia de extracción (>97%) de la matriz de chile/capsicum. El estudio también abordó la pérdida previamente inexplicada de carotenoides durante la saponificación al agregar buffer de fosfato a la mezcla de muestra-extracto, lo que evitó la formación de micelas de jabón. Además, la duración y temperatura del procedimiento de saponificación y el pH de la solución de extracción final fueron optimizados para lograr una mayor recuperación total de carotenoides. Se identificaron un total de 48 carotenoides libres y unidos en las muestras de frutas de capsicum utilizando UHPLC-DAD-MS/MS. El contenido total de carotenoides dentro de seis frutas de pimiento y chile varió entre 1,63 (pimiento verde) y 32,08 mg/100 g de peso fresco (pimiento dulce rojo bebé). La metodología actual podría potencialmente ser utilizada en una amplia gama de diferentes matrices y productos que contienen carotenoides.