El objetivo del presente estudio fue investigar si las diferencias de fertilidad en los toros se reflejan en variaciones de la calidad del esperma al analizar solo un eyaculado por macho. Se realizaron dos experimentos. En el primer experimento, se probaron muestras de semen congelado de 20 toros adultos; 10 toros tenían alta fertilidad en campo y 10 toros tenían baja fertilidad en campo. Se realizaron análisis de motilidad espermática, integridad de la membrana e integridad de la membrana-acrosoma con el método ISAS3Fun. También se analizó la morfometría espermática de las subpoblaciones de esperma fluorescente obtenidas con el método ISAS3Fun. Se encontraron diferencias significativas entre los grupos de alta y baja fertilidad solo con la técnica ISAS3Fun, específicamente en la integridad del acrosoma espermático, la proporción de espermatozoides con un acrosoma intacto y membrana dañada, y en el ancho de la cabeza de los espermatozoides con estructuras intactas. Los análisis discriminantes nos permitieron clasificar correctamente el 90% de las muestras de esperma en su grupo de fertilidad utilizando parámetros de calidad del esperma. Dado que solo los resultados obtenidos con la técnica ISAS3Fun estaban relacionados con la fertilidad del toro, realizamos un segundo experimento con el objetivo de validar la eficacia de esta técnica para detectar la integridad acrosomal de los espermatozoides de toro, comparándolos con la combinación convencional de FITC-PNA/ioduro de propidio (PNA/PI) bajo condiciones de capacitación. Los resultados indicaron que la combinación ISAS3Fun proporcionó una evaluación precisa tanto de la viabilidad como de la integridad acrosomal para los espermatozoides eyaculados, mientras que la combinación PNA/PI subestimó la extensión del daño acrosomal debido a falsos negativos. Se concluyó que la evaluación simultánea de las membranas plasmáticas espermáticas y la integridad del acrosoma con el método ISAS3Fun es precisa y parece tener un mayor potencial para discriminar entre toros de alta y baja fertilidad que las pruebas de calidad del esperma in vitro más convencionales.