Los polisorbatos son los surfactantes predominantes utilizados para estabilizar formulaciones de proteínas. Desafortunadamente, los polisorbatos pueden sufrir degradación hidrolítica, lo que libera ácidos grasos que pueden acumularse para formar partículas visibles. La detección y cuantificación de estos productos de degradación de ácidos grasos son críticos para evaluar la extensión de la degradación de polisorbato y los riesgos asociados con la formación de partículas. Anteriormente desarrollamos un método espectrométrico de masas fácil de usar llamado Ácidos Grasos por Espectrometría de Masas (FAMS) para cuantificar los ácidos grasos libres. El método FAMS fue validado de acuerdo con las pautas de la ICH Q2 (R1) y es adecuado para una amplia gama de productos, buffers y concentraciones de proteínas. El flujo de trabajo de principio a fin se puede automatizar desde la preparación de la muestra hasta el análisis de datos. Para ampliar la accesibilidad del método, el detector QDa seleccionado para la medición de ácidos grasos no requiere experiencia específica en espectrometría de masas. Aquí proporcionamos un procedimiento detallado tanto para la preparación manual como automatizada de muestras para análisis de alto rendimiento. Además, destacamos en este protocolo los detalles operativos críticos, las precauciones procedimentales y consejos para la resolución de problemas para apoyar la ejecución exitosa de este método en otro laboratorio.