Los exosomas extracelulares (EVs) son nanopartículas secretadas por las células, encapsuladas en membranas lipídicas y sin núcleo funcional. EV es un término general que incluye varios subtipos de partículas llamadas microvesículas, micropartículas, ectosomas o exosomas. Los EVs transfieren carga de ARN, ADN y proteínas entre células y tejidos próximos y distantes, constituyendo así una red de transducción de señales en todo el organismo. Los tejidos patológicos secretan EVs que difieren en la composición de su carga en comparación con sus contrapartes sanas. La detección de biomarcadores en EVs de fluidos biológicos puede ayudar en el diagnóstico de enfermedades y/o monitorear su progresión de manera mínimamente invasiva. Entre los fluidos biológicos, los derrames pleurales (PEs) están integrados en la práctica clínica, ya que acompañan a una amplia variedad de trastornos pulmonares. Debido a la proximidad con la pleura y los pulmones, se espera que los PEs estén especialmente enriquecidos en EVs que se originan en tejidos enfermos. Sin embargo, los PEs son uno de los fluidos biológicos menos estudiados en cuanto a métodos de aislamiento especializados de EVs y biomarcadores relacionados. Aquí describimos un método práctico de aislamiento de EVs de PEs para el cribado de biomarcadores de ARN de EVs en la rutina clínica. Se basa en un paso de tratamiento con Proteinasa K para digerir contaminantes antes de la precipitación estándar con polietilenglicol. La eficacia del método fue confirmada mediante microscopía electrónica de transmisión, análisis de seguimiento de nanopartículas y Western blot. También se demostró la fiabilidad y sensibilidad del método hacia la detección de biomarcadores de ARN enriquecidos en EVs de múltiples PEs.