Las células de Sertoli (SCs) son esenciales para mantener el desarrollo de las células germinales. La metformina, el principal tratamiento farmacológico para la diabetes tipo 2 pediátrica, se administra a los niños durante la maduración de las SC. El presente estudio tuvo como objetivo analizar si la metformina afecta el metabolismo energético de las SC y la integridad de la barrera hematotesticular (BTB). Se utilizaron cultivos primarios de SC para los estudios in vitro. Los efectos in vivo se estudiaron en ratas Sprague-Dawley tratadas con 200 mg/kg de metformina desde Pnd14 hasta Pnd30. La metformina disminuyó la oxidación de ácidos grasos y aumentó la producción de 3-hidroxibutirato in vitro. Además, disminuyó la resistencia eléctrica transepitelial a través del monocapa e indujo la redistribución de ZO-1, sugiriendo una alteración de las uniones celulares. In vivo, se observó un aumento leve pero significativo en la permeabilidad de la BTB y la expresión de ZO-1 en el grupo de metformina, sin cambios en la histología testicular y el progreso de la meiosis. Además, las ratas adultas que recibieron tratamiento con metformina durante el período juvenil no mostraron alteraciones en la permeabilidad de la BTB ni en la producción diaria de esperma. En conclusión, la exposición a la metformina puede afectar la permeabilidad de la BTB en ratas juveniles, pero esto parece no influir en el progreso de la espermatogénesis. Considerando los resultados obtenidos en animales adultos, es posible especular que el tratamiento con metformina durante el período juvenil no afecta la función testicular en la adultez.