Actualmente, la quimioterapia combinada basada en 5-fluorouracilo (5-FU) es la base del tratamiento del cáncer colorrectal metastásico (CRC), que beneficia aproximadamente al 50% de los pacientes. Sin embargo, estos tumores inevitablemente adquieren quimiorresistencia, lo que resulta en el fracaso del tratamiento. Los mecanismos moleculares que impulsan la resistencia adquirida a los fármacos quimioterapéuticos en el CRC son fundamentales para el desarrollo de nuevas estrategias para eludir la resistencia. Sin embargo, el fenómeno específico que impulsa a las células cancerosas a adquirir resistencia se comprende poco. Comprender los mecanismos moleculares que regulan la quimiorresistencia descubrirá nuevas vías para el tratamiento del CRC. Entre los diversos mecanismos de quimiorresistencia adquirida, los defectos en las vías de metabolismo de fármacos podrían desempeñar un papel importante. En el caso del 5-FU, se convierte en varios metabolitos activos que, directa o indirectamente, interfieren con la replicación y transcripción de las células en división, causando daño en el ADN y el ARN. En este proyecto, desarrollamos un método basado en espectrometría de masas de alta resolución para extraer y cuantificar eficazmente los niveles de los metabolitos de 5-FU en lisados celulares y medios de células parentales y resistentes a 5-FU LIM1215. El análisis destacó que los niveles de metabolitos de 5-FU están significativamente reducidos en células resistentes a 5-FU. Específicamente, el nivel del nucleótido fluorodeoxuridina monofosfato (FdUMP) se reduce con el tratamiento de 5-FU, aclarando el metabolismo comprometido de 5-FU en células resistentes. Corroborando el análisis metabolómico, el tratamiento de las células resistentes con FdUMP, un metabolito activo de 5-FU, resultó en la muerte efectiva de las células resistentes. En general, en este estudio, se desarrolló un protocolo eficaz para la cuantificación comparativa de metabolitos polares y análogos de nucleótidos a partir de células adherentes de manera eficiente. Además, se destaca la utilidad de FdUMP como una alternativa para la terapia del CRC.