Los zooplancton son componentes clave de las redes tróficas estuarinas. Sin embargo, el monitoreo rutinario se ve obstaculizado por la dificultad de la identificación basada en la morfología. Los métodos basados en ADN nos permiten sortear algunos de estos obstáculos, proporcionando identificaciones precisas de especies independientemente de la experiencia taxonómica del investigador o de la etapa de desarrollo de los especímenes. Sin embargo, el proceso depende de la completitud de las bibliotecas de referencia. En este estudio, buscamos evaluar el potencial del metabarcoding de ADN para evaluar las dinámicas estacionales (verano, otoño y principios de primavera) y espaciales de los zooplancton (cuatro ubicaciones que abarcan aproximadamente 6 km) en el estuario de Lima (noroeste de Portugal). Se utilizaron dos marcadores genéticos: la subunidad I de la citocromo c oxidasa y la región hipervariable V4 de los genes del ARN ribosómico 18S. En total, se recuperaron 327 especies, y ambos marcadores mostraron una superposición mínima (el 7% se detectó con ambos marcadores). La riqueza de especies, la composición y la distintividad taxonómica fueron influenciadas principalmente por la temporada, con una tendencia a la disminución desde el verano (el mayor número de especies exclusivas, n = 74) hasta la primavera. En segundo lugar, la composición de los taxones fue influenciada por la variación espacial, donde el sitio más aguas abajo mostró el mayor número de especies exclusivas, n = 53. Se detectaron un total de 16 especies no indígenas utilizando metabarcoding, pero solo una ha sido documentada en el estuario. En conclusión, tanto los gradientes estacionales como espaciales influyeron en la riqueza, composición y distintividad taxonómica recuperadas, confirmando la gran aptitud del metabarcoding de ADN para proporcionar un monitoreo de mayor densidad y arrojar nueva luz sobre la composición y dinámicas de comunidades complejas de zooplancton.