La enfermedad corneal se ha convertido en la segunda causa principal de ceguera en el mundo. El trasplante de córnea se considera actualmente uno de los tratamientos comunes para la pérdida de visión. Este documento presenta un enfoque novedoso que utiliza membranas de doble entrecruzamiento compuestas de polirotaxano, múltiples aldehídos (PRAs), 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) y N-hidroxysuccinimida (NHS) en el proceso de desarrollo. El colágeno fue entrecruzado, respectivamente, por EDC/NHS y PRAs para formar enlaces amida estables y grupos imina. A través de la formación de una red interpenetrante doble, las membranas de doble entrecruzamiento (Col-EDC-PRA) exhibieron una resistencia mejorada a la degradación por colagenasa y propiedades mecánicas superiores en comparación con las membranas entrecruzadas con un solo agente de entrecruzamiento. Además, las membranas Col-EDC-PRA muestran características favorables de transmitancia de luz y contenido de agua. Los experimentos celulares mostraron que las membranas Col-EDC-PRA no eran citotóxicas y no presentaron diferencias significativas con respecto a otras membranas. En un modelo de queratoplastia en conejos, la reparación estromal corneal ocurrió a los 5 meses, evidenciada por la presencia de células estromales y neo-estroma, como se muestra en secciones histológicas teñidas con hematoxilina-eosina y en imágenes de tomografía de coherencia óptica del segmento anterior. Además, no hubo inflamación ni neovascularización corneal, así como tampoco reacción de rechazo corneal en el área quirúrgica. En general, los resultados demostraron que las membranas de doble entrecruzamiento sirvieron eficazmente para la regeneración del tejido corneal después de un defecto corneal.