La remediación del suelo para la toxicidad por cadmio (Cd) es esencial para el cultivo y producción exitosos de tabaco. La aplicación de melatonina puede aliviar el estrés por metales pesados y promover el crecimiento de las plantas; sin embargo, aún no está del todo claro si la suplementación con melatonina puede remediar los efectos de la toxicidad por Cd en el crecimiento y desarrollo de plántulas de tabaco. En este estudio, evaluamos el efecto de la melatonina aplicada al suelo sobre la acumulación de Cd en plántulas de tabaco, así como las respuestas en el crecimiento, parámetros fisiológicos y bioquímicos, y la expresión de genes relacionados con el estrés. Nuestros resultados demuestran que la aplicación de melatonina mitigó el estrés por Cd en el tabaco, promoviendo así el crecimiento de la planta. Aumentó el peso fresco de las raíces, el peso seco, el peso fresco de los brotes y el peso seco en un 58.40%, 163.80%, 34.70% y 84.09%, respectivamente, en comparación con el control. Los análisis fisiológicos también mostraron diferencias significativas en la tasa fotosintética y la formación de pigmentos entre los tratamientos, siendo las mejoras más altas registradas para la aplicación de melatonina. Además, la aplicación de melatonina alivió el daño oxidativo inducido por Cd al reducir el contenido de MDA y aumentar las actividades de los antioxidantes enzimáticos (CAT, SOD, POD y APX), así como de los antioxidantes no enzimáticos (GSH y AsA). Además, la imagenología microscópica confocal confirmó la efectividad de la aplicación de melatonina para mantener la integridad celular bajo estrés por Cd. Las observaciones de Microscopia Electrónica de Barrido (SEM) ilustraron el papel aliviante de la melatonina sobre los estomas y las características ultraestructurales bajo la toxicidad por Cd. El análisis de qRT-PCR reveló que la aplicación de melatonina aumentó la expresión de genes relacionados con la fotosíntesis y los antioxidantes, incluyendo , , y , en las hojas de tabaco. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la melatonina aplicada al suelo puede promover la tolerancia del tabaco al estrés por Cd al modular cambios morfo-fisiológicos y bioquímicos, así como la expresión de genes relevantes.