El cáncer mamario es una enfermedad frecuente en perras, donde una alta proporción de casos corresponde a tumores malignos que pueden exhibir resistencia a los fármacos. Dentro del microambiente tumoral mamario, hay una subpoblación celular llamada células madre cancerosas (CSCs), que son capaces de formar esferas in vitro y resistir tratamientos anti-tumorales, explicando en parte la recurrencia de algunos tumores. Anteriormente, se ha descrito que las esferas derivadas de células de carcinoma mamario canino CF41.Mg y REM 134 exhiben características de pluripotencia. La melatonina ha mostrado efectos anti-tumorales en células de tumores mamarios; sin embargo, sus efectos han sido poco evaluados en CSCs mamarias caninas. Este estudio tuvo como objetivo analizar el efecto de la melatonina en la quimiorresistencia exhibida por células neoplásicas similares a células madre derivadas de carcinoma mamario canino a fármacos citotóxicos como la doxorubicina y la mitoxantrona. Las células CF41.Mg y REM 134 se cultivaron en DMEM de alta glucosa suplementado con suero bovino fetal y L-glutamina. Las esferas se cultivaron en placas de baja adherencia en medio DMEM/F12 sin suero bovino fetal y con diferentes factores de crecimiento. Se analizó el fenotipo CD44/CD24 mediante citometría de flujo. La viabilidad de las células derivadas de esferas (reducción de MTS) se estudió en presencia de melatonina (0.1 o 1 mM), doxorubicina, mitoxantrona y luzindol. Además, se analizaron los genes (RT-qPCR) de las bombas de resistencia a múltiples fármacos en presencia de melatonina. Ambos tipos de células expresaron el gen que codifica el receptor de melatonina MT1. La melatonina a 1 mM no modifica el fenotipo CD44/CD24; sin embargo, la hormona redujo la viabilidad (< 0.0001) solo en esferas CF41.Mg, sin inducir un efecto aditivo cuando se co-incubó con fármacos citotóxicos. Estos efectos fueron independientes de la unión de la hormona a su receptor MT1, ya que, al inhibirlos farmacológicamente, el efecto de la melatonina no fue bloqueado. En las esferas CF41.Mg, la expresión relativa del gen fue disminuida en respuesta a la hormona (< 0.001). Estos resultados indican que la melatonina modula negativamente la supervivencia celular de las esferas derivadas de células CF41.Mg, de una manera que es independiente de su receptor MT1. Estos efectos no contrarrestaron la resistencia a la doxorubicina y la mitoxantrona, a pesar de que la hormona regula negativamente la expresión génica de .