La endometritis bovina se caracteriza por una reducción en la producción de leche y altas tasas de infertilidad. Investigaciones previas han indicado que la melatonina puede poseer propiedades antiinflamatorias y antioxidantes que pueden contrarrestar la progresión de enfermedades inflamatorias. En esta investigación, intentamos elucidar los efectos protectores de la melatonina en la endometritis inducida por LPS. Los resultados obtenidos de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) y PCR cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) revelaron que la melatonina redujo efectivamente la producción y liberación de citoquinas proinflamatorias en una línea celular epitelial endometrial bovina inducida por LPS (células BEND). Además, la transferencia de proteínas mostró que el tratamiento con melatonina redujo los niveles de expresión de las proteínas relacionadas con el inflamasoma de la familia de receptores tipo NOD que contienen dominio de pirina 3 (NLRP3), incluyendo NLRP3, caspasa-1 activada y IL-1beta cortada. Es importante destacar que demostramos que el efecto antiinflamatorio de la melatonina en las células BEND estaba relacionado con la autofagia mediante transferencia de proteínas. Además, utilizamos la transferencia de proteínas para detectar proteínas relacionadas con la autofagia, MitoSOX para detectar la producción de especies reactivas de oxígeno mitocondrial (mtROS) y un ensayo de potencial de membrana mitocondrial (MMP) para detectar el potencial de membrana mitocondrial. La administración de melatonina demostró una mejora significativa en la autofagia dentro de las células BEND, lo que llevó a la eliminación efectiva de mitocondrias dañadas. Este proceso resultó en una reducción en la generación de especies reactivas de oxígeno dentro de las mitocondrias, restauración del potencial de membrana mitocondrial e inhibición de la activación del inflamasoma NLRP3. Además, en un modelo de ratón de endometritis inducida por LPS, el tratamiento con melatonina reprimió la expresión de citoquinas proinflamatorias mediante ELISA y qRT-PCR, alivió los cambios patológicos mediante tinción de hematoxilina-eosina (H&E) e inhibió la actividad de mieloperoxidasa (MPO). En conclusión, nuestro estudio mostró que la melatonina inhibió la activación del inflamasoma NLRP3 en las células BEND a través de la autofagia, lo que puede proporcionar una nueva estrategia terapéutica para la endometritis bovina.