La comprensión de la regulación estomática en el estrés climático es esencial para garantizar cultivos resilientes. La investigación de la regulación estomática en el estrés combinado de calor y sequía tuvo como objetivo vincular los efectos de la melatonina exógena en la conductancia estomática (g) y sus interacciones mecánicas con la señalización de ABA o ROS. Las plántulas de tomate tratadas con melatonina y no tratadas fueron sometidas a niveles moderados y severos de calor (38 grados C durante uno o tres días) y estrés por sequía (contenido de agua relativa del suelo del 50% o 20%) aplicados individualmente y en combinación. Medimos g, anatomía estomática, metabolitos de ABA y antioxidantes enzimáticos de ROS. Los estomas en estrés combinado respondieron predominantemente al calor con un contenido de agua relativa del suelo (SRWC) = 50% y al estrés por sequía con SRWC = 20%. El estrés por sequía aumentó los niveles de ABA en estrés severo, mientras que el estrés por calor causó una acumulación de la forma conjugada, éster de glucosa de ABA, tanto en estrés moderado como severo. El tratamiento con melatonina afectó g y la actividad de las enzimas antioxidantes de ROS, pero no tuvo efecto en los niveles de ABA. El metabolismo de ABA y la conjugación de ABA podrían desempeñar un papel en la apertura estomática hacia altas temperaturas. Proporcionamos evidencia de que la melatonina aumenta g en el estrés combinado de calor y sequía, pero el efecto no se media a través de la señalización de ABA.