Los protoplastos son una herramienta versátil en la biotecnología vegetal, ya que se pueden utilizar tanto para estudios biológicos básicos como para estrategias de mejoramiento basadas en la edición del genoma. Un protocolo eficiente de aislamiento de protoplastos es esencial para llevar a cabo estudios basados en protoplastos. Para optimizar el protocolo de aislamiento de protoplastos en col (var. L.), se probaron diferentes soluciones enzimáticas para el aislamiento de protoplastos del mesófilo de las hojas. En nuestros experimentos, la combinación de 0.5% de Celulasa Onozuka RS y 0.1% de Macerozyme R-10 mostró el mejor resultado. El protocolo optimizado demostró ser adecuado para el aislamiento de protoplastos de cinco cultivares diferentes de col, con rendimientos que oscilan entre 2.38 y 4.63 x 10 protoplastos/g de peso fresco (pf) y una viabilidad del 93% o más. Después de tres semanas en cultivo, los protoplastos de todos los cultivares probados formaron microcallos, pero el crecimiento adicional del callo y la regeneración de brotes dependieron en gran medida del genotipo y del protocolo de regeneración utilizado. Para la formación de brotes, 1 mg/L de BAP en combinación con auxina 0.2 mg/L de NAA mostró los mejores resultados con una regeneración del 23.5%. Los resultados obtenidos contribuirán al desarrollo de diferentes aplicaciones de protoplastos de col y facilitarán el proceso de mejoramiento de este importante cultivo hortícola.