El nitrógeno del suelo (N) es crítico para el rendimiento de los cultivos. Aunque estudios anteriores han demostrado que el retorno de paja mejora la disponibilidad de N mineral en el suelo, la respuesta de los microbios de los agregados del suelo al retorno de la paja y su impacto en la disponibilidad de N mineral en el suelo sigue siendo incierto. Llevamos a cabo un experimento de 13 años para explorar cómo el potencial de mineralización de N del suelo, los hongos y las bacterias dentro de los agregados del suelo respondieron al retorno de la paja. Nuestros hallazgos indicaron que el retorno de la paja aumentó significativamente las concentraciones de N mineral en los macroagregados del suelo, sin observar un efecto estadísticamente significativo en la composición de los microagregados. Observamos un aumento en la diversidad alfa de la comunidad microbiana, una mayor estabilidad de la red de co-ocurrencia y un aumento en los grupos funcionales asociados con el N (respiración de nitrato, desnitrificación, desnitrificación de nitrito) y el carbono (saprótrofos, saprótrofos-simbiontes, patosaprótrofos) en los agregados. Además, los microorganismos en los macroagregados fueron influenciados por el N total, mientras que los de los microagregados fueron afectados por el carbono orgánico total del suelo y la relación C-N. Un análisis de red de sensibilidad identificó microorganismos específicos que responden al retorno de la paja. Dentro de los macroagregados, los cambios en la comunidad microbiana explicaron el 42.88% de la variación del N mineral, con la beta-diversidad bacteriana y fúngica contribuyendo con un 27.82% y un 12.58%, respectivamente. Además, el retorno de la paja reguló al alza los genes de ciclado de N (amonificación de N: , , y ; nitrificación: ; desnitrificación: , , , , y ; y fijación de N: ) en los macroagregados. Un modelo de trayectoria de mínimos cuadrados parciales reveló que la disponibilidad de N en los macroagregados fue impulsada principalmente por la amonificación, con la beta-diversidad bacteriana explicando el 23.22% y la beta-diversidad fúngica el 15.16% de la variación. Nuestro estudio revela que los macroagregados, que desempeñan un papel crucial en el suministro de N del suelo, son altamente sensibles a las prácticas de labranza. Este hallazgo proporciona un enfoque práctico para reducir la dependencia de los fertilizantes de N sintético promoviendo el ciclado de N mediado por microbios, al tiempo que se mantienen altos rendimientos de cultivos en sistemas agrícolas intensivos.