La transferencia de núcleos de células somáticas o la microinyección de citoplasma se ha utilizado ampliamente para producir animales de granja editados genéticamente; sin embargo, estos métodos tienen varias desventajas que reducen su eficiencia. En el presente estudio, describimos un enfoque fácilmente adaptable para la introducción de mutaciones utilizando la electroporación de cigotos con CRISPR-Cas9 (CRISPR-EP) en búfalos. El objetivo del estudio fue determinar las condiciones óptimas para un método experimental en el que el sistema CRISPR/Cas9 se introduce en cigotos de búfalo producidos in vitro mediante electroporación. La electroporación se realizó utilizando diferentes combinaciones de voltaje, pulsos y tiempo, y observamos que la electroporación en cigotos de búfalo a 20 V/mm, 5 pulsos, 3 mseg a 10 h post inseminación (hpi) resultó en un aumento de la permeabilidad de la membrana y una mayor eficiencia de knockout sin alterar el potencial de desarrollo embrionario. Usando los parámetros anteriores, dirigimos el gen POU5F1 de búfalo como prueba de concepto y no encontramos variaciones en la competencia de desarrollo embrionario en la tasa de segmentación o formación de blastocistos entre los embriones de control, POU5F1-KO y los embriones de control electroporados (EC). Para elucidar el efecto de POU5F1-KO en otros genes pluripotentes, determinamos la expresión relativa de SOX2, NANOG y GATA2 en el blastocisto de control (POU5F1 intacto) y el blastocisto confirmado como POU5F1-KO. POU5F1-KO significativamente.