La regeneración de novo de L. (cannabis) utilizando técnicas de cultivo de tejidos sigue siendo poco fiable e infrecuente. Los métodos convencionales para la regeneración y transformación de cannabis no han logrado la fiabilidad y replicabilidad que deben integrarse en programas de investigación y cría. Los sistemas de protoplastos son efectivos para estudios de expresión génica y transformación, y las tecnologías de edición del genoma abren la posibilidad de hibridación somática para crear híbridos interespecíficos. Hasta la fecha, se han aislado protoplastos derivados de hojas para estudios de expresión génica transitoria, pero no se ha informado sobre la regeneración de protoplasto a planta. El presente estudio tiene como objetivo evaluar la eficacia de utilizar un sistema de cultivo de callos como fuente abundante de tejido para el aislamiento de protoplastos y sienta las bases para un sistema de regeneración de protoplasto a planta. Utilizando cultivos de callos derivados de hipocotilos, que se sabe que tienen un potencial regenerativo relativamente mayor, se evaluó la eficacia del aislamiento de protoplastos y la división celular inicial. En este estudio, se evaluó el efecto del ácido 2-aminoindano-2-fosfónico (AIP), un inhibidor competitivo de la fenilalanina amoníaco liasa (PAL), en los medios de cultivo de callos y el efecto de la frecuencia de subcultivo en el rendimiento de protoplastos. Este estudio encontró que la inclusión de AIP a 1 mM resultó en un aumento del 334% en el rendimiento de protoplastos en comparación con el medio sin AIP, representando el primer uso conocido de AIP en el cultivo de tejidos de cannabis. La inclusión de AIP llevó a una disminución del 28% en los fenoles solubles totales y una disminución del 52% en el pardeamiento del tejido en comparación con el medio de control. Por último, se probó un sistema de cultivo en dos fases para la regeneración de protoplastos. A una concentración de 2.0 x 10 protoplastos por mL, se observaron la reconstitución de la pared celular y la división celular, proporcionando uno de los primeros informes conocidos de división celular a partir de protoplastos de cannabis y preparando el terreno para el futuro desarrollo de un sistema de regeneración de protoplasto a planta.