La proteómica de abajo hacia arriba se basa en una digestión eficiente con tripsina antes del análisis por espectrometría de masas (MS). Estudios previos han sugerido que la digestión a temperaturas elevadas acelera la proteólisis, mostrando un aumento en el número de péptidos identificados por MS. Sin embargo, una mejor cobertura de secuencia puede ser consecuencia de una digestión parcial, ya que las temperaturas más altas desestabilizan y degradan la enzima, causando que la actividad mejorada sea de corta duración. Aquí, utilizamos un ensayo espectroscópico (BAEE) para cuantificar la actividad de la tripsina estabilizada por calcio a lo largo del tiempo completo de una digestión. A 47 grados C, la adición de calcio contribuye a un aumento de 25 veces en la estabilidad de la tripsina. Las temperaturas más altas muestran una disminución neta en la actividad acumulativa de la tripsina. A través del análisis de MS de abajo hacia arriba de un extracto de proteoma de levadura, demostramos que una digestión de 1 hora a 47 grados C con 10 mM de Ca proporciona un aumento del 29% en el número total de identificaciones de péptidos. Al mismo tiempo, la proporción cuantitativa de péptidos con 1 o más sitios de corte perdidos se redujo en la digestión a 47 grados C, apoyando una mayor eficiencia de digestión con el protocolo de 1 hora. La especificidad de la tripsina también mejora, como se observa por una disminución en la abundancia cuantitativa de péptidos semi-trípticos. Nuestro protocolo de digestión mejorado aumenta el rendimiento para la preparación de muestras de abajo hacia arriba y valida el enfoque como una alternativa robusta y de bajo costo para maximizar la eficiencia de digestión de proteínas.