La producción de leche en vacas Holstein en un entorno semiárido es un desafío debido al estrés térmico. En tales condiciones, la selección genética para la tolerancia al calor parece ser una estrategia útil. El objetivo fue validar marcadores moleculares asociados con la producción de leche y rasgos de termotolerancia en vacas Holstein manejadas en un ambiente caluroso y húmedo. Vacas en lactancia (n = 300) expuestas a un ambiente de estrés térmico fueron genotipadas utilizando un arreglo de densidad media que incluía 53,218 SNPs. Un estudio de asociación del genoma completo (GWAS) detectó seis SNPs asociados con el rendimiento total de leche (MY305) que superaron la prueba de múltiples comparaciones (p < 1.14 x 10). Estos SNPs fueron validados en 216 vacas Holstein de dos poblaciones independientes que fueron genotipadas utilizando el método de discriminación bi-alélica TaqMan y qPCR. En estas vacas, solo los SNPs rs8193046, rs43410971 y rs382039214, dentro de los genes correspondientes, fueron asociados (p < 0.05) con MY305, temperatura rectal (RT) y tasa respiratoria. Curiosamente, estas variables mejoraron a medida que el número de genotipos favorables de los SNPs aumentó de 0 a 3. Además, un análisis de regresión detectó RT como un predictor significativo (R = 0.362) para MY305 en vacas con más de 1 genotipo favorable, sugiriendo que esta estrecha relación fue influenciada por marcadores genéticos. En conclusión, los SNPs en los genes mencionados parecen estar involucrados en el mecanismo molecular que regula la producción de leche en vacas bajo condiciones de estrés térmico. Se proponen estos SNPs como marcadores genéticos de termotolerancia para un programa de selección destinado a mejorar el rendimiento lechero de las vacas Holstein en lactancia manejadas en un entorno semiárido.