La mejora de la calidad de la fibra de algodón sigue siendo un desafío fundamental en los programas de mejoramiento debido a la compleja arquitectura genética subyacente al desarrollo de la fibra. La estrecha base genética del algodón de tierras altas y la naturaleza cuantitativa de los rasgos de calidad de la fibra requieren enfoques innovadores para identificar e incorporar alelos superiores de especies relacionadas. Desarrollamos una población BCF al introgresar segmentos cromosómicos de la variedad de algodón de isla marina Xinhai 36 en la variedad de algodón de tierras altas Xinluzhong 60. Basándonos en la fenotipificación de la resistencia de la fibra, construimos dos grupos de ADN que representan fenotipos extremos (20 individuos superiores y 12 inferiores) para el análisis de segregación agrupada por secuenciación (BSA-Seq). La secuenciación de alto rendimiento generó 225.13 Gb de datos en bruto con profundidades promedio de 20x para los padres y 30x para los grupos. La llamada y anotación de SNP se realizaron utilizando GATK y ANNOVAR contra el genoma de referencia del algodón de tierras altas (TM-1). El análisis de BSA-Seq identificó 13 QTLs agrupados principalmente dentro de una región de 1.6 Mb (20.6-22.2 Mb) en el cromosoma A10. Dentro de esta región, detectamos genes de mutación no sinónimos que involucran un total de seis genes. Los análisis de enriquecimiento de GO y KEGG revelaron un enriquecimiento significativo para procesos metabólicos de carbohidratos, modificación de proteínas y vías de biosíntesis de metabolitos secundarios. La integración con datos de transcriptoma priorizó el gen , que codifica una proteína de la familia de beta-amilasas, como el gen candidato clave. La validación funcional a través de sobreexpresión y silenciamiento por RNAi demostró que regula significativamente el contenido de almidón y la actividad de beta-amilasa, aunque sin alteraciones morfológicas visibles. Este estudio identificó con éxito regiones genómicas potenciales y genes candidatos asociados con la resistencia de la fibra de algodón utilizando líneas de sustitución de segmentos cromosómicos combinadas con BSA-Seq. El gen candidato clave proporciona un objetivo valioso para la selección asistida por marcadores en los programas de mejoramiento del algodón. Nuestros hallazgos establecen una base para comprender los mecanismos moleculares de la formación de la calidad de la fibra y ofrecen recursos genéticos para desarrollar variedades de algodón superiores con mayor resistencia de fibra.