La cultura a largo plazo de tejido testicular tiene aplicaciones importantes, incluida la preservación del potencial de fertilidad de niños prepuberales que se someten a tratamientos oncológicos gonadotóxicos. Este estudio fue diseñado para definir las condiciones óptimas para la cultura a largo plazo de tejido testicular porcino neonatal como modelo animal para individuos preadolescentes. Se utilizaron testículos de lechones donantes de 1 semana de edad para examinar los efectos del tamaño de los fragmentos de tejido (~2, 4, 6 u 8 mg), el método de preparación (fragmentos intactos, semi-digeridos o físicamente dispersos) y la fuente de suero en los medios (suero bovino fetal-FBS-o sustituto de suero knockout-KSR). Los fragmentos testiculares se examinaron semanalmente durante 4 semanas para evaluar la integridad del tejido, la densidad y morfología de los cordones seminíferos, y el conteo de gonocitos. La integridad del tejido testicular dependía del tamaño del fragmento y del método de preparación, donde el tamaño más pequeño (2 mg, < 0.05) y el método de preparación intacto fueron ventajosos (< 0.05). La densidad de los cordones seminíferos disminuyó durante el período de cultivo (< 0.05). Aunque el número relativo de gonocitos disminuyó con el tiempo para todos los tamaños y métodos (< 0.01), los fragmentos intactos más pequeños (2 y 4 mg) presentaron un mayor número de gonocitos (< 0.05). Nuestros hallazgos sugieren que los fragmentos testiculares intactos o físicamente dispersos del tamaño más pequeño (2 mg) cultivados en medios suplementados con KSR podrían mantenerse eficazmente in vitro durante un período de 4 semanas.