Mejorar el desarrollo de las raíces es fundamental para aumentar el rendimiento de los cultivos y mejorar la resistencia al estrés. En este estudio, exploramos los efectos regulatorios de los xilo-oligosacáridos (XOS) en el crecimiento de las raíces de lechuga, comparando su impacto con el del sal potásico del ácido indol-3-butírico (IBAP). El tratamiento con XOS condujo a un aumento sustancial en el peso seco de las raíces (30.77%), la longitud total de las raíces (29.40%), el volumen (21.58%) y el área superficial (25.44%) en comparación con el control tratado con agua. Estas mejoras fueron comparables a las inducidas por IBAP. Un perfil completo de fitohormonas reveló aumentos marcados en el ácido indol-3-acético (IAA), ribósido de zeatina (ZR), jasmonato de metilo (JA-ME) y brasinosteroides (BRs) tras la aplicación de XOS. A través de la secuenciación de ARN, identificamos 3807 genes expresados diferencialmente (DEGs) en las raíces de las plantas tratadas con XOS, que estaban significativamente enriquecidos en vías asociadas con la homeostasis del ion manganeso, la actividad del motor de microtúbulos y el metabolismo de carbohidratos. Curiosamente, aproximadamente el 62.7% de los DEGs sensibles a XOS también respondieron a IBAP, subrayando mecanismos regulatorios comunes. Sin embargo, XOS influyó de manera única en genes relacionados con la biosíntesis de cutina, suberina y ceras, así como en la transducción de señales de hormonas vegetales, lo que sugiere nuevos mecanismos de tolerancia al estrés. La prominente regulación al alza de genes que codifican beta-glucosidasa y beta-fructofuranosidasa destaca el metabolismo de carbohidratos mejorado como un motor clave de la mejora de raíces inducida por XOS. En conjunto, estos resultados posicionan a XOS como una opción prometedora y sostenible para la biostimulación agrícola.