Localización de Rab22a de pollo en células y su relación con moléculas y genes BF o Ii
Autores: Yu, Fengmei; Raheem, Muhammad Akmal; Tan, Yang; Rahim, Muhammad Ajwad; Zha, Lisha; Zhang, Jun; Zhu, Zhiwei; Li, Zhonghua; Chen, Fangfang
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2023
Acceso abierto
Artículo científico
2023
Localización de Rab22a de pollo en células y su relación con moléculas y genes BF o Ii
Categoría
Ciencias Agrícolas y Biológicas
Subcategoría
Zootecnia
Palabras clave
Pequeña GTPasa
Transporte intracelular
Morfología de endosomas
Moléculas MHC
Co-localización
Expresión génica
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 9
Citaciones: Sin citaciones
Rab22a es una importante proteína GTPasa pequeña que está involucrada en el transporte intracelular y la regulación de proteínas. También juega un papel importante en la captación de antígenos, el transporte, la regulación de la morfología de los endosomas y regula el transporte de antígenos a las moléculas del MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad). Para investigar el papel de Rab22a, se estudió la co-localización intracelular de la molécula de Rab22a de pollo (cRab22a) y su relación con las moléculas BF y la cadena invariante de pollo (cIi). Se construyó una estructura proteica 3D de Rab22a utilizando herramientas informáticas (DNASTAR 4.0 y DNAMAN). Basado en el modelo, se construyeron los plásmidos eucariotas recombinantes correspondientes mediante mutaciones puntuales en los dominios estructurales de la proteína. Las células HEK 293T fueron co-transfectadas con plásmidos pEGFP-C1-cIi para observar la co-localización intracelular. En segundo lugar, las células dendríticas DC2.4 de ratón y las células murinas RAW 264.7 fueron transfectadas con plásmidos recombinantes de pmCherry-cRab22a y pmCherry-mRab22a respectivamente. Posteriormente, se observó la localización intracelular de cRab22a en endosomas tempranos y tardíos con anticuerpos específicos contra EEA1 y LAMP1 respectivamente. Para estudios basados en la expresión génica, el gen cRab22a fue regulado a la baja y a la alza en células HD11, siguiendo la detección de los niveles de transcripción de los genes BFa (MHCIa) y cIi mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Las interacciones del gen cRab22a con BFa y cIi fueron detectadas mediante co-inmunoprecipitación (Co-IP) y Western blot. Los resultados mostraron que las estructuras proteicas de Rab22a de pollo y ratón eran altamente homólogas (95.4%), y ambas se localizan en los endosomas tempranos y tardíos. Ser41 y Tyr74 son aminoácidos clave en las regiones Switch de Rab22a que mantienen su localización intracelular. La regulación a la baja de la expresión del gen cRab22a redujo significativamente (< 0.01) la transcripción de BFa (MHCIa) y cIi en células HD11. Sin embargo, cuando la expresión del gen cRab22a se incrementó 55 veces en comparación con las células de control, la expresión del gen BFa (MHCIa) aumentó 1.7 veces en comparación con las células de control (< 0.01), mientras que la expresión del gen cIi no difirió significativamente del control (> 0.05). Los resultados de Western blot mostraron que cRab22a no podía unirse directamente a BFa y cIi. Por lo tanto, cRab22a puede regular las moléculas de proteínas BFa y cIi de manera indirecta. Se concluye que cRab22a se localizó con cIi en el endosoma. Las regiones Switch de cRab22a son los dominios clave que afectan la localización intracelular y la colocalización de la molécula cIi.
Descripción
Rab22a es una importante proteína GTPasa pequeña que está involucrada en el transporte intracelular y la regulación de proteínas. También juega un papel importante en la captación de antígenos, el transporte, la regulación de la morfología de los endosomas y regula el transporte de antígenos a las moléculas del MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad). Para investigar el papel de Rab22a, se estudió la co-localización intracelular de la molécula de Rab22a de pollo (cRab22a) y su relación con las moléculas BF y la cadena invariante de pollo (cIi). Se construyó una estructura proteica 3D de Rab22a utilizando herramientas informáticas (DNASTAR 4.0 y DNAMAN). Basado en el modelo, se construyeron los plásmidos eucariotas recombinantes correspondientes mediante mutaciones puntuales en los dominios estructurales de la proteína. Las células HEK 293T fueron co-transfectadas con plásmidos pEGFP-C1-cIi para observar la co-localización intracelular. En segundo lugar, las células dendríticas DC2.4 de ratón y las células murinas RAW 264.7 fueron transfectadas con plásmidos recombinantes de pmCherry-cRab22a y pmCherry-mRab22a respectivamente. Posteriormente, se observó la localización intracelular de cRab22a en endosomas tempranos y tardíos con anticuerpos específicos contra EEA1 y LAMP1 respectivamente. Para estudios basados en la expresión génica, el gen cRab22a fue regulado a la baja y a la alza en células HD11, siguiendo la detección de los niveles de transcripción de los genes BFa (MHCIa) y cIi mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Las interacciones del gen cRab22a con BFa y cIi fueron detectadas mediante co-inmunoprecipitación (Co-IP) y Western blot. Los resultados mostraron que las estructuras proteicas de Rab22a de pollo y ratón eran altamente homólogas (95.4%), y ambas se localizan en los endosomas tempranos y tardíos. Ser41 y Tyr74 son aminoácidos clave en las regiones Switch de Rab22a que mantienen su localización intracelular. La regulación a la baja de la expresión del gen cRab22a redujo significativamente (< 0.01) la transcripción de BFa (MHCIa) y cIi en células HD11. Sin embargo, cuando la expresión del gen cRab22a se incrementó 55 veces en comparación con las células de control, la expresión del gen BFa (MHCIa) aumentó 1.7 veces en comparación con las células de control (< 0.01), mientras que la expresión del gen cIi no difirió significativamente del control (> 0.05). Los resultados de Western blot mostraron que cRab22a no podía unirse directamente a BFa y cIi. Por lo tanto, cRab22a puede regular las moléculas de proteínas BFa y cIi de manera indirecta. Se concluye que cRab22a se localizó con cIi en el endosoma. Las regiones Switch de cRab22a son los dominios clave que afectan la localización intracelular y la colocalización de la molécula cIi.