La obesidad causada por una dieta alta en grasas (HFD) afecta la microbiota intestinal vinculada al riesgo de diabetes tipo 2 (T2D). Este estudio evalúa las células vivas y el extracto etanólico (SEL) de Probio65 y Probio-093 como compuestos naturales anti-diabéticos. Los efectos anti-diabéticos in vitro se determinaron en función de la inhibición de las enzimas alfa-glucosidasa y alfa-amilasa. El SEL de Probio65 y Probio-093 retardó significativamente las enzimas alfa-glucosidasa y alfa-amilasa (< 0.05). Las células vivas de Probio65 y Probio-093 inhibieron la alfa-glucosidasa y la alfa-amilasa, respectivamente (< 0.05). En ratones alimentados con una dieta alta en grasas (HFD) del 45% de kcal, el SEL y las células vivas de ambas cepas redujeron significativamente el peso corporal en comparación con el control HFD (< 0.05). Probio-093 también mejoró el nivel de glucosa en sangre en comparación con el control (< 0.05). Los efectos moduladores de la microbiota intestinal de los lactobacilos en ratones diabéticos inducidos por HFD se analizaron con el método qPCR. El SEL y las células vivas de ambas cepas redujeron los filos en comparación con el control HFD (< 0.05). El SEL y las células vivas de Probio-093 promovieron más (filo) y (género) en comparación con el control (< 0.05). Ambas cepas ejercieron efectos moduladores metabólicos, siendo la cepa Probio-093 la que mostró una alteración más prominente en la microbiota intestinal, corroborando el papel de los probióticos en las modulaciones de la microbiota intestinal y el efecto anti-diabético. Ambos lactobacilos son candidatos potenciales para reducir la diabetes tipo 2 vinculada a la obesidad.