Las plantas se exponen con frecuencia a diversos estreses abióticos, entre los cuales el estrés por baja temperatura afecta notablemente el crecimiento y las funciones fisiológicas. Los factores de transcripción WRKY son reguladores clave en las respuestas de las plantas al estrés abiótico. En este estudio, se clonó un nuevo gen de factor de transcripción WRKY, de trébol blanco. La caracterización funcional reveló que la proteína de longitud completa posee características típicas de los factores de transcripción, incluida la actividad de activación transcripcional ubicada en su dominio C-terminal. La expresión heteróloga de en mejoró significativamente la tolerancia al frío bajo estrés de baja temperatura. Los ensayos fisiológicos mostraron que las líneas transgénicas presentaron un mayor contenido de clorofila y actividades elevadas de superóxido dismutasa (SOD), peroxidasa (POD) y catalasa (CAT) en comparación con las plantas silvestres. Además, Protenix se utilizó para predecir los genes diana potenciales de los factores de transcripción TrWRKY, y se analizaron sus perfiles de expresión para ayudar a dilucidar la red regulatoria subyacente a la tolerancia al frío. El análisis de qRT-PCR confirmó que varios genes sensibles al frío, como y , se expresaron significativamente más en las líneas transgénicas. En conjunto, estos hallazgos indican que desempeña un papel regulador positivo en mejorar la tolerancia al frío, proporcionando valiosas ideas sobre los mecanismos moleculares de resistencia al frío en trébol blanco y ofreciendo genes candidatos prometedores para mejorar la resistencia al estrés en cultivos forrajeros.