La secuenciación de ARN dirigida revela el transcriptoma de un modelo de infección in vivo
Autores: Cornejo-Granados, Fernanda; López-Leal, Gamaliel; Mata-Espinosa, Dulce A.; Barrios-Payán, Jorge; Marquina-Castillo, Brenda; Equihua-Medina, Edgar; Zatarain-Barrón, Zyanya L.; Molina-Romero, Camilo; Hernández-Pando, Rogelio; Ochoa-Leyva, Adrian
Idioma: Inglés
Editor: MDPI
Año: 2021
Acceso abierto
Artículo científico
2021
La secuenciación de ARN dirigida revela el transcriptoma de un modelo de infección in vivo
Categoría
Ciencias Naturales y Subdisciplinas
Subcategoría
Biología
Palabras clave
Interacciones huésped-patógeno
Modelos in vivo
Mycobacterium tuberculosis
Sistema de lisis diferencial
Enfoque de RNA-seq
Expresión génica.
Licencia
CC BY-SA – Atribución – Compartir Igual
Consultas: 21
Citaciones: Sin citaciones
El estudio de las interacciones huésped-patógeno utilizando modelos in vivo con patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis (Mtb) conlleva limitaciones técnicas, tales como: (i) seleccionar un sistema de lisis diferencial eficiente para enriquecer las células patógenas; (ii) obtener suficiente ARN de alta calidad; y (iii) lograr una eliminación eficiente de rARN. Así, algunos autores han utilizado citómetros de flujo para separar células infectadas o aumentar significativamente la profundidad de secuenciación de las bibliotecas de ARN huésped-patógeno para observar la expresión génica de los patógenos. Sin embargo, estas opciones conllevan gastos adicionales en equipos especializados que típicamente no están disponibles para todos los laboratorios. Aquí, proponemos un protocolo experimental que involucra lisis celular diferencial y una eliminación ribosomal basada en sondas para determinar la expresión génica de Mtb y su huésped durante la infección in vivo. Este método aumentó el número de genes expresados por el patógeno observados de 13 utilizando el enfoque tradicional de RNA-seq a 702. Después de eliminar las lecturas de rARN, observamos que el 61.59% de las secuencias de Mtb representaban 702 genes, mientras que el 38.41% representaban regiones intergénicas. Algunos de los genes más expresados codificaban para transposasa IS1081 (Rv2512c) y ocho miembros de PE-PGRS, como PGRS49 y PGRS50. Como era de esperar, un porcentaje crítico de los genes expresados codificaba para proteínas secretadas esenciales para la infección, como PE68, lppN y LpqH. Además, tres ncARN de Mtb fueron altamente expresados (pequeño ARN MTS2823, ARN de transferencia-mensajero RF00023 y ribozima RF00010). Muchos de los genes expresados por el huésped estaban relacionados con el proceso inflamatorio y la expresión de proteínas surfactantes como Sftpa y Sftpc, conocidas por unir Mtb a macrófagos alveolares y mi638, un microARN sin asociaciones previas con enfermedades pulmonares. El objetivo principal de este estudio es presentar el método y un catálogo general de los genes expresados por Mtb en un momento de la infección in vivo. Creemos que nuestro método representa un enfoque diferente a los existentes para estudiar las interacciones huésped-patógeno en tuberculosis y otras infecciones intracelulares similares, sin la necesidad de equipos especializados.
Descripción
El estudio de las interacciones huésped-patógeno utilizando modelos in vivo con patógenos intracelulares como Mycobacterium tuberculosis (Mtb) conlleva limitaciones técnicas, tales como: (i) seleccionar un sistema de lisis diferencial eficiente para enriquecer las células patógenas; (ii) obtener suficiente ARN de alta calidad; y (iii) lograr una eliminación eficiente de rARN. Así, algunos autores han utilizado citómetros de flujo para separar células infectadas o aumentar significativamente la profundidad de secuenciación de las bibliotecas de ARN huésped-patógeno para observar la expresión génica de los patógenos. Sin embargo, estas opciones conllevan gastos adicionales en equipos especializados que típicamente no están disponibles para todos los laboratorios. Aquí, proponemos un protocolo experimental que involucra lisis celular diferencial y una eliminación ribosomal basada en sondas para determinar la expresión génica de Mtb y su huésped durante la infección in vivo. Este método aumentó el número de genes expresados por el patógeno observados de 13 utilizando el enfoque tradicional de RNA-seq a 702. Después de eliminar las lecturas de rARN, observamos que el 61.59% de las secuencias de Mtb representaban 702 genes, mientras que el 38.41% representaban regiones intergénicas. Algunos de los genes más expresados codificaban para transposasa IS1081 (Rv2512c) y ocho miembros de PE-PGRS, como PGRS49 y PGRS50. Como era de esperar, un porcentaje crítico de los genes expresados codificaba para proteínas secretadas esenciales para la infección, como PE68, lppN y LpqH. Además, tres ncARN de Mtb fueron altamente expresados (pequeño ARN MTS2823, ARN de transferencia-mensajero RF00023 y ribozima RF00010). Muchos de los genes expresados por el huésped estaban relacionados con el proceso inflamatorio y la expresión de proteínas surfactantes como Sftpa y Sftpc, conocidas por unir Mtb a macrófagos alveolares y mi638, un microARN sin asociaciones previas con enfermedades pulmonares. El objetivo principal de este estudio es presentar el método y un catálogo general de los genes expresados por Mtb en un momento de la infección in vivo. Creemos que nuestro método representa un enfoque diferente a los existentes para estudiar las interacciones huésped-patógeno en tuberculosis y otras infecciones intracelulares similares, sin la necesidad de equipos especializados.