La optimización de la relación entre sumidero y fuente es de gran importancia para la regulación del rendimiento de los cultivos. El pepino es un cultivo típico que transporta oligosacáridos de la familia de la rafinosa (RFO). La metilación del ADN es una modificación epigenética común en las plantas, pero su papel en la regulación de la relación sumidero-fuente no ha sido demostrado en especies que translocan RFO. Aquí, se realizó una secuenciación de bisulfito de genoma completo (WGBS-seq) para comparar las hojas de nodos no fructíferos (NFNLs) y las hojas de establecimiento de frutos (FNLs) en el duodécimo nodo, eliminando todas las flores femeninas en otros nodos de los dos tratamientos. Encontramos genes diferencialmente metilados considerablemente enriquecidos en procesos de fotosíntesis y metabolismo de carbohidratos. El análisis comparativo del transcriptoma entre FNLs y NFNLs indicó que muchos genes expresados diferencialmente (DEGs) con regiones metiladas diferencialmente estaban involucrados en el metabolismo de auxinas, etileno y brassinolida; metabolismo de sacarosa; y vías de síntesis de RFO relacionadas con la regulación de la relación sumidero-fuente. Además, los niveles de metilación del ADN de seis genes relacionados con la relación sumidero-fuente en las vías mencionadas disminuyeron en las hojas después del tratamiento con 5-aza-dC-2-deoxicitidina (5-Aza-dC, un inhibidor de la metiltransferasa de ADN) en FNLs, y la expresión del gen de sintasa de estachiosa, la actividad enzimática y el contenido de estachiosa en la vía de síntesis de RFO se reguló al alza, aumentando así la longitud y el peso seco del fruto. En conjunto, nuestros hallazgos proponen una inferencia actualizada sobre el papel potencial de la metilación del ADN en la relación sumidero-fuente, lo que proporcionará referencias importantes para explorar más a fondo el mecanismo molecular de la metilación del ADN en la mejora del rendimiento de las plantas que transportan RFO.