El nitrógeno (N) afecta fuertemente el crecimiento y el metabolismo de las plantas. Aunque se ha reportado toxicidad por amonio, los efectos del nitrógeno en la biosíntesis de shikonina permanecen oscuros. En este estudio, probamos cuatro concentraciones diferentes de NH en raíces peludas (AEHR) para aclarar la influencia del NH en el crecimiento de AEHR y en la acumulación de shikoninas en ellas y los posibles mecanismos. Los resultados mostraron que en comparación con el tratamiento de 0% de NH (solo nitrato como fuente de nitrógeno), el tratamiento de 10% de NH aumentó el peso fresco y el peso seco de AEHR y promovió la síntesis de shikoninas. En contraste, el tratamiento de 20% de NH comenzó a mostrar efectos de inhibición en el crecimiento y la acumulación de shikoninas en AEHR, y el tratamiento de 30% de NH exhibió los efectos de inhibición más fuertes. Con un mayor porcentaje de NH, los AEHR se volvieron más cortos y más gruesos, con más ramas. Para elucidar aún más los mecanismos, analizamos la asimilación de nitrógeno en el tiempo, el nivel de expresión génica de enzimas clave involucradas en la vía de biosíntesis de shikonina y el contenido de varias hormonas endógenas en presencia de concentraciones tóxicas de NH. Los resultados indicaron que la auxina y la citoquinina podrían regular el crecimiento y la arquitectura de AEHR bajo la toxicidad de NH y revelaron que el nivel de jasmonato se redujo junto con la inhibición de la biosíntesis de shikonina. Esta primera investigación exhaustiva de los efectos de la relación amonio/nitrato en la biosíntesis de shikonina no solo proporciona datos valiosos para optimizar el cultivo in vitro y su producción de shikonina, sino que también sugiere estrategias potenciales de fertilización para su cultivo.