El semen criopreservado se utiliza ampliamente en técnicas de reproducción asistida. Los espermatozoides post-descongelación soportan estrés oxidativo debido a los altos niveles de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, que se producen durante el proceso de congelación/descongelación, y la depleción de antioxidantes. Para contrarrestar esta depleción, se ha aplicado ampliamente la suplementación del medio de preparación de espermatozoides con antioxidantes. La melatonina es una hormona con diversos roles biológicos y un potente antioxidante, con un efecto ameliorativo sobre los espermatozoides. En el presente estudio, evaluamos el efecto de la melatonina en espermatozoides bovinos descongelados durante su manipulación. Los espermatozoides bovinos criopreservados fueron descongelados e incubados durante 60 minutos en presencia o ausencia de 100 melatonina. Además, se evaluó el efecto de la melatonina en espermatozoides desafiados adicionalmente por la adición de 100 peróxido de hidrógeno. Los espermatozoides fueron evaluados en términos de parámetros cinemáticos (CASA), viabilidad (tinción con azul de trypan) y capacidad antioxidante (glutatión y ensayo de NBT, determinación de niveles de iNOS mediante análisis de Western blot). En presencia de melatonina, los espermatozoides presentaron mejores parámetros cinemáticos, ya que el porcentaje de espermatozoides móviles y rápidos fue mayor en el grupo de melatonina. También presentaron mayor viabilidad y estado antioxidante, como se determinó por el aumento de los niveles celulares de glutatión y la disminución de los niveles de proteína iNOS.