La producción de soja es actualmente insuficiente para satisfacer la demanda global, lo que destaca la necesidad de estrategias para mejorar el crecimiento. La melatonina (MT) ha surgido como una solución prometedora debido a sus propiedades que promueven el crecimiento. Este estudio investigó los efectos de un tratamiento dual de MT, que combina el remojo de semillas y la pulverización foliar, en el metabolismo del carbono y nitrógeno de la soja mediante análisis metabolómico. Los resultados demostraron que el tratamiento con MT aumentó significativamente el ciclo de TCA, proporcionando energía y precursores para la síntesis de aminoácidos y carbohidratos. Las vías clave de aminoácidos, incluyendo el metabolismo de histidina y fenilalanina, se vieron mejoradas, con el metabolismo de histidina estimulando la síntesis de purinas para mejorar la fijación biológica de nitrógeno y el metabolismo de fenilalanina promoviendo la producción de metabolitos secundarios para apoyar el crecimiento. Además, las vías de carbohidratos como el metabolismo de almidón y sacarosa y la glucólisis/gluconeogénesis fueron reguladas positivamente, asegurando el suministro de energía y la homeostasis del carbono. En general, el tratamiento dual con MT mejoró la capacidad metabólica de la soja al promover el metabolismo de aminoácidos y carbohidratos, estimular la producción de purinas y metabolitos secundarios, y mantener el equilibrio de carbono y nitrógeno. Estos hallazgos subrayan el papel regulador de la melatonina en el crecimiento de la soja y proporcionan ideas para mejorar la productividad de los cultivos.