La hibridación de ARN (ISH) se utiliza para visualizar patrones de expresión génica espacio-temporales con amplias aplicaciones en biología y biomedicina. Aquí proporcionamos un protocolo para ISH de ARNm en alas y abdominales de pupas en desarrollo para especies modelo y no modelo. Describimos las mejores prácticas en la etapificación de pupas, preparación de tejidos, diseño y síntesis de sondas, imagen de patrones de expresión génica y técnicas de edición de imágenes. Este protocolo ha sido utilizado con éxito para investigar los roles de genes subyacentes a la evolución de nuevos patrones de color en especies no modelo.