(1) Antecedentes: Se han explorado las funciones de la familia de tropomiosina (TPM) en tumores y cánceres; sin embargo, se han observado diferencias notables. Este estudio tiene como objetivo profundizar nuestra comprensión de los efectos de las TPM en glioma y encontrar nuevos biomarcadores para glioma. (2) Métodos: Se descargaron datos de RNA-seq de TCGA y GTEx. Se llevaron a cabo análisis de supervivencia, regresión de Cox, nomograma, curvas de calibración, curvas ROC, análisis de enriquecimiento de función génica y análisis de infiltración de células inmunitarias utilizando R. Se utilizó el ensayo CCK8, mientras que el ensayo de Brdu, el ensayo de formación de colonias y el ensayo de Transwell se utilizaron para verificar las funciones de TPM3 en glioma. (3) Resultados: TPM1/3/4 se expresaron significativamente más en glioma que en tejidos normales, mientras que una mayor expresión de TPM2/3/4 se correlacionó con una peor supervivencia general que una menor expresión de TPM2/3/4. Además, los análisis bioinformáticos indicaron que TPM3/4 podrían ser factores promotores de una peor supervivencia en glioma, pero solo TPM3 podría servir como un factor pronóstico independiente. Los análisis de función génica mostraron que las TPM pueden estar involucradas en respuestas inmunitarias. Además, investigaciones experimentales adicionales verificaron que la sobreexpresión de TPM3 mejoró la proliferación y la tumorigenicidad del glioma. (4) Conclusiones: La alta expresión de TPM3/4 se correlacionó positivamente con un peor pronóstico en glioma, y TPM3 podría servir como un nuevo factor pronóstico independiente del glioma.