La criopreservación de esperma es una técnica efectiva para conservar la diversidad genética animal y transmitir antecedentes genéticos superiores, mantenida a través de un muestreo y recolección no invasivos de grandes cantidades de esperma. Sin embargo, la criopreservación en especies aviares no es comercialmente viable debido a la susceptibilidad del esperma de gallo a daños. Este estudio tiene como objetivo estimar el impacto del dimetilacetamida (DMA) como crioprotector en diferentes niveles (3%, 6% o 9%) sobre la calidad del esperma post-descongelado, la motilidad, los biomarcadores antioxidantes y la expresión de genes relacionados con el anticongelante. Se recolectaron muestras de semen dos veces por semana de doce gallos de 40 semanas de edad, con un peso de 3400 +/- 70 g, pertenecientes a la cepa de pollo Cairo-B2. Las muestras de semen fresco fueron rápidamente evaluadas, agrupadas, diluidas con dos volúmenes de un extensor básico y divididas en tres grupos iguales. Los grupos diluidos fueron enfriados a -20 grados C durante 7 minutos, luego se les añadió suavemente DMA preenfriado al 3%, 6% o 9% y se equilibraron a 5 grados C durante 10 minutos más. Se formaron pellets de semen mediante la pipeteo de gotas a 7 cm sobre nitrógeno líquido (LN), que luego se mantuvieron dentro de crioviales en el LN. La descongelación se realizó 2 meses después tomando 3-4 pellets del semen congelado en un tubo de vidrio y calentándolo en un baño de agua durante 8 segundos a 60 grados C. Los resultados mostraron que el 3% de DMA aumentó la proporción de esperma total móvil, la progresividad, la viabilidad y la integridad de la membrana plasmática (%) en comparación con los grupos de 6% y 9% de DMA. La peroxidación lipídica y la actividad de la enzima antioxidante mejoraron en el grupo del 3%. Al mismo tiempo, algunas expresiones de genes relacionados con el anticongelante (incluyendo el miembro de la familia de homólogos de ras A (RHOA), la proteína de choque térmico 70 (HSP70) y el polipéptido A de ribonucleoproteína nuclear pequeña (SNRPA1)) se regularon al alza dentro del grupo del 3% de DMA en relación con otros grupos. En conclusión, el grupo del 3% de DMA mantuvo una calidad de esperma post-descongelado más alta que los otros grupos probados.