La caracterización de los mecanismos que confieren resistencia a los herbicidas en las malas hierbas es esencial para desarrollar programas de manejo efectivos. Este estudio se centró en caracterizar el nivel de resistencia y los principales mecanismos que confieren resistencia al glifosato en una población resistente (R) recolectada en un campo de arroz colombiano en 2020. La población R mostró una resistencia 11.2 veces mayor en comparación con una población susceptible (S). Los mecanismos de resistencia en sitios no objetivo (NTSR) que redujeron la absorción y afectaron la translocación y el metabolismo del glifosato no estuvieron involucrados en la resistencia al glifosato en la población R. Al evaluar los mecanismos de resistencia en el sitio objetivo mediante ensayos de actividad enzimática y secuenciación del gen (5-enolpiruvilshikimato-3-fosfato sintasa), se encontró la mutación Pro106Ser en plantas R. Estos hallazgos son cruciales para gestionar la propagación de la resistencia en Colombia. Para controlar efectivamente en el futuro, es imperativo que los agricultores utilicen herbicidas con diferentes mecanismos de acción además del glifosato y adopten Programas de Manejo Integrado para controlar las malas hierbas en los campos de arroz de los valles centrales de Colombia.