La criopreservación de semen es una tecnología crucial para mejorar la eficiencia reproductiva en la producción ganadera; sin embargo, el daño a los espermatozoides inducido por estrés oxidativo durante el proceso de congelación-descongelación sigue siendo un desafío significativo. En este estudio, se utilizó metabolómica para analizar las diferencias en los metabolitos en el semen de ganado Qinchuan con diferente tolerancia a la congelación y para seleccionar los marcadores candidatos de tolerancia a la congelación de espermatozoides. Los resultados de metabolómica indican que se identificaron un total de 264 metabolitos diferenciales, y la anotación de la vía KEGG reveló que el metabolismo de aminoácidos (15.07%) estaba representado de manera prominente, y la L-glutamina (L-Gln) mostró una abundancia particularmente alta en el grupo de alta capacidad de congelación (HFG) en comparación con el grupo de baja capacidad de congelación (LFG). Experimentos adicionales demostraron que la suplementación con L-glutamina mejoró significativamente la motilidad espermática post-descongelación, la integridad de la membrana plasmática y la integridad acrosomal (< 0.05). También mejoró la capacidad antioxidante de los espermatozoides al aumentar las actividades de la superóxido dismutasa (SOD), la glutatión peroxidasa (GSH-Px) y la catalasa (CAT), mientras que redujo el contenido de malondialdehído (MDA) (< 0.05). Además, la L-Gln mantuvo la función mitocondrial y la homeostasis energética al elevar el potencial de membrana mitocondrial (MMP) y promover la fosforilación de AMPK (< 0.05). Estos resultados indican que la L-glutamina alivia el daño oxidativo durante la criopreservación y mejora la tolerancia a la congelación del semen.