La hormona foliculoestimulante (FSH) regula el desarrollo de los folículos ováricos a través de programas específicos de expresión génica. Las células de la granulosa (GCs) son células somáticas que rodean los ovocitos, secretando gonadotropinas para regular la ovulación y promover el desarrollo folicular. Al analizar los efectos de diferentes dosis de FSH en la proliferación de GCs, encontramos que añadir 10 ng/mL de FSH, como concentración óptima, podría promover el crecimiento de GCs. Además, hemos construido con éxito la primera biblioteca de knockout CRISPR-Cas9 dirigida a los genes en los cromosomas 2 y 3 y en el cromosoma X del gen de codificación masiva de ovejas, así como una biblioteca de células knockout de GCs ováricas. Por primera vez, hemos expuesto la biblioteca de células knockout a una concentración de 10 ng/mL de FSH para explorar los mecanismos subyacentes. A través de este cribado, hemos identificado 836 genes de cribado positivo-negativo que son sensibles a la FSH, revelando así los mecanismos regulatorios y evaluando la funcionalidad de los genes candidatos. A continuación, el RNA-Seq de dosis de control (0 ng/mL), baja (10 ng/mL) y alta (100 ng/mL) de FSH reveló 1708 genes expresados diferencialmente, y combinado con 836 genes, obtuvimos 129 genes dependientes de la dosis de FSH con diferencias extremadamente significativas. Esto nos permite profundizar en la investigación e identificación de los mecanismos por los cuales la FSH regula las GCs. Más generalmente, hemos descubierto nuevos factores regulatorios e identificado efectores principales asociados a la reproductividad. Estos hallazgos proporcionan nuevas direcciones de investigación para estudios futuros sobre la reproducción de ovejas.