A pesar del uso creciente de protoplastos en la investigación biotecnológica de plantas, la regeneración de brotes a partir de protoplastos sigue siendo un desafío. En este estudio, investigamos los factores involucrados en la aislamiento de protoplastos, inducción de callos y regeneración de brotes en la cv. Mirage Rose. Se encontraron las siguientes condiciones como las más óptimas para el rendimiento y viabilidad de protoplastos: 0.6 M de manitol, 2.0% de celulasa y un tiempo de digestión de 6 h. Una densidad de siembra de 10 x 10 protoplastos/mL bajo condiciones de osmótico (0.58 M de manitol) mostró alta viabilidad de microcolonias en cultivo líquido. Se encontró que el medio de Kao y Michayluk era apropiado para la proliferación de callos a partir de microcallos bajo un fotoperíodo de luz de 16 h. Los callos cultivados en medio de Murashige y Skoog que contenía 1.0 mg/L de 6-benzilaminopurina y 0.2 mg/L de ácido 3-indol butírico mostraron la mayor frecuencia de regeneración de brotes y el número de brotes obtenidos por explante. El análisis de amplificación aleatoria de ADN polimórfico mostró que los brotes derivados de protoplastos exhibieron los mismos patrones de bandas que los de las plantas donantes. En conjunto, estos hallazgos pueden contribuir a resolver problemas encontrados en el aislamiento de protoplastos y la regeneración de brotes en otros cultivares de petunia y especies relacionadas. Dado que el protocolo desarrollado por nosotros es altamente reproducible, puede aplicarse en la investigación biotecnológica sobre la cv. Mirage Rose.