Los defectos cardíacos congénitos (CHD) son el tipo más común de defectos de nacimiento. Varios estudios de casos en humanos y modelos animales genéticamente alterados han identificado anomalías en el desarrollo del sistema de conducción ventricular (VCS) en el corazón. Aunque las terapias basadas en células prometen tratar los CHDs, los esfuerzos de traducción se ven limitados por la falta de modelos in vitro adecuados para estudios de viabilidad y seguridad. Un mejor entendimiento de las vías de diferenciación celular puede llevar al desarrollo de terapias basadas en células para individuos que viven con trastornos de CHD/VCS. Aquí, describimos un nuevo y reproducible método de cultivo celular en 3-D para estudiar la diferenciación de linajes celulares cardíacos in vitro. Utilizamos células ventriculares primarias aisladas de embriones de ratón del día 11.5 de gestación (E11.5), las cuales pueden diferenciarse en múltiples tipos celulares cardíacos incluyendo células VCS. Comparamos cultivos en 3-D con tres tipos de extractos de membrana basal (BME) por su capacidad de apoyar la diferenciación de células ventriculares E11.5. Además, se probaron los efectos del péptido natriurético atrial (ANP) y un inhibidor de su receptor de alta afinidad en la diferenciación celular en los cultivos en 3-D. Tras el cultivo celular, se describen protocolos para imágenes de inmunofluorescencia, extracción celular y aislamiento de proteínas de la matriz de cultivo en 3-D y métodos de inmunotransferencia en células. Además, estos enfoques pueden ser utilizados para estudiar los efectos de varios ligandos e intervenciones genéticas en el desarrollo de células VCS. Proponemos que estas metodologías también pueden ser ampliadas para estudios de diferenciación utilizando otras fuentes de células madre como las células madre pluripotentes inducidas.