En este protocolo, presentamos un método para medir la disfunción mitocondrial para confirmar la transición epitelial-mesenquimal (EMT) en células de cáncer de páncreas en un entorno hipóxico. Hay muchos métodos expertos y complicados para verificar la EMT. Sin embargo, nuestros métodos han indicado que la EMT se puede identificar examinando los cambios en la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el potencial de membrana en las mitocondrias. Para demostrar si los cambios en los indicadores de disfunción mitocondrial están correlacionados con la EMT, también se observaron la morfología celular y la expresión de E-cadherina y N-cadherina. Los resultados verificaron que una disminución en el potencial de membrana y un aumento en ROS en las mitocondrias estaban asociados con la EMT de las células de cáncer de páncreas. Este protocolo sería útil como base para proporcionar un indicador adicional de los cambios en el microambiente tumoral de las células de cáncer de páncreas relacionados con la EMT en un entorno hipóxico.