Los pétalos de ssp. y ssp. son púrpuras y amarillos, respectivamente. La hibridación libre entre ssp. y ssp. ha creado híbridos con varios colores de flores en la naturaleza. Además, los colores de las flores de alfalfa están estrechamente correlacionados con el rendimiento, la calidad nutricional, la tolerancia al estrés y otras características agronómicas. Para elucidar los mecanismos subyacentes de la formación del color de las flores en ssp. y ssp., realizamos un análisis integrador del transcriptoma y metaboloma de alfalfa con tres colores de pétalos diferentes (púrpura, amarillo y crema). Los perfiles metabólicos sugirieron que los antocianos y los carotenoides son los pigmentos cruciales en las flores púrpuras y amarillas, respectivamente. Una exploración cuantitativa de los componentes de antocianos y carotenoides indicó que las acumulaciones de derivados de cianidina, delphinidina, peonidina, malvidina, pelargonidina y petunidina son significativamente más altas en flores púrpuras que en flores crema. Además, el contenido de carotenos (fitona, alfa-caroteno y beta-caroteno) y xantofilas (alfa-criptoxantina, luteína, beta-criptoxantina, zeaxantina, anteraxantina y derivados de violaxantina) fue notablemente más alto en flores amarillas que en flores crema. Además, encontramos que el delphinidina-3,5-O-diglucósido y la luteína eran los pigmentos predominantes acumulados en flores púrpuras y amarillas, respectivamente. Los resultados transcriptómicos revelaron que veinticinco genes estructurales regulados al alza (uno, tres, doce, dos, uno, uno, uno y cuatro) están involucrados en la acumulación de antocianos en flores púrpuras, y nueve genes estructurales (dos, uno, dos, dos, uno y uno) ejercen un efecto en la vía de biosíntesis de carotenoides en flores amarillas. Los hallazgos de este estudio revelan los mecanismos subyacentes de la biosíntesis de antocianos y carotenoides en alfalfa con tres colores clásicos de flores.