Los castaños son una fuente esencial tanto de alimentos como de madera. Sin embargo, las graves amenazas de plagas invasoras y enfermedades comprometen su existencia y productividad. En Europa, se han iniciado programas de hibridación de castaños para producir portainjertos resilientes en respuesta a la enfermedad de la tinta. Sin embargo, la brecha en la identificación de estas plantas híbridas suele basarse en observaciones de campo y características morfológicas, lo que sigue siendo un desafío. Nuestro estudio presenta un conjunto de marcadores para distinguir entre el híbrido de castaño CA90 (x), un híbrido con resistencia demostrada a , y otras variedades utilizando marcadores microsatélites (SSR) y herramientas bioinformáticas. Utilizamos 35 muestras de castaño, incluidos tres controles CA90, híbridos muestreados en Portugal, con el objetivo de definir los perfiles de los híbridos y variedades de castaño en este estudio basados en patrones de bandas y motivos SSR. Se seleccionaron y modificaron nueve cebadores SSR distintos con características alélicas nulas de 43 marcadores ya desarrollados de microsatélites (SSR) simples. La amplificación por PCR y la electroforesis en gel de agarosa se utilizaron para amplificar y visualizar las bandas de ADN. Para confirmar las variaciones genéticas, se secuenciaron 27 bandas amplificadas mediante secuenciación de Sanger. Este análisis identificó 31 SSR en 22 secuencias que contienen SSR, con repeticiones de trinucleótidos (67,74%) siendo las más comunes, seguidas por repeticiones de dinucleótidos (22,58%), mononucleótidos (6,45%) y hexanucleótidos (3,23%). Se observaron un total de 18 alelos para los nueve loci. Los alelos variaban de uno a tres por locus para las 35 muestras. El nuevo locus CP4 solo se pudo encontrar en híbridos CA90. Esta herramienta puede ayudar en la identificación y selección de híbridos resistentes a enfermedades, contribuyendo así a la producción y estrategias de manejo de castaños.